INSTRUCCIONES PARA EL CULTIVO MICROBIANO DE BACTERIAS BIOLUMINISCENTES

CULTIVO DE BACTERIAS BIOLUMINISCENTES

⌬ Al preparar cultivos líquidos de bacterias, lo mejor es usar una pequeña porción de medio centímetro de bacterias frescas cultivadas para inocular los nutrientes del caldo líquido. ¡Por eso proporcionamos 2 viales de 5 ml de bacterias bioluminiscentes y suficientes nutrientes (agar) para cultivar múltiples cultivos! 

⌬ Para cultivar más bacterias, hemos incluido 1 tubo de medio de agar de AMPICILINA en polvo (suficientes nutrientes de agar para 7 cultivos en placa) y 3 tubos de medio de caldo de AMPICILINA en polvo (suficientes nutrientes líquidos para 3 cultivos líquidos de 250 ml) 

⌬ ¡Todo esto a partir de un solo y diminuto vial de 5 ml de bacterias! 

QUÉ INCLUYE:

⌬ 1 botella de vidrio de 250 ml

⌬ 1 tubo de agar AMP GEL

⌬ 3 tubos de agar de CALDO LÍQUIDO AMP

⌬ 7 placas de Petri

⌬ 10 guantes de nitrilo

⌬ 5 asas de inoculación estériles

⌬ 1 tubo cónico medidor de 50 ml

⌬ 5 pipetas desechables

⌬ 1 vial de H2O estéril 

⌬ 2 viales de bacterias e. coli no patógenas (¡1 extra!)

     - plásmido modificado de vibrio fischeri PJE202

⌬ PASO 1: PREPARACIÓN DE PLACAS DE AGAR

⌬ Este paso es crucial para cultivar más bacterias. Debe preparar sus placas de nutrientes para que puedan crecer y multiplicarse, y así pueda recolectar más bacterias para usarlas posteriormente en cultivos líquidos. 

• Vierta el contenido del tubo único etiquetado como MEDIO DE AGAR LB AMPICILINA en la botella de vidrio de 250 ml. (Este es el agar para verter las placas)
• Añada 150 ml de agua del grifo a la botella de vidrio usando el tubo cónico etiquetado como MEASURE (3 tubos - 50 ml cada uno)
• Agite bien y coloque la botella de vidrio en el microondas con la tapa desenroscada y apoyada ligeramente encima. 
• NO APRIETE LA TAPA EN EL MICROONDAS.
• Caliente la botella en el microondas durante unos segundos a la vez (5-10 segundos) y tenga cuidado de no hervir demasiado el contenido. 
• Abra el microondas y déjela reposar unos segundos para que se enfríe. 
• Continúe calentándola en el microondas en intervalos cortos sin que hierva durante 2-5 minutos, o hasta que el líquido se vuelva amarillo claro y transparente sin partículas visibles.
• Retire la botella del microondas y déjela enfriar hasta que alcance una temperatura tibia (20-30 minutos).
• Mientras la botella aún esté tibia, vierta las placas de Petri una por una.
• Retire la tapa de cada placa y vierta solo el agar suficiente para cubrir la mitad inferior de la placa (1-2 mm de profundidad).
• Vuelva a colocar las tapas con cuidado y deje que las placas se enfríen a temperatura ambiente durante al menos una hora. El agar se solidificará al enfriarse.

⌬ PASO 2: PREPARACIÓN DE PLACAS DE AGAR CON BACTERIAS (7 placas)

• Con una pipeta, añada 4 gotas de H2O estéril al vial etiquetado como BACTERIAS LIOFILIZADAS. Enrosque la tapa y agite durante unos segundos.
• Añada todas las bacterias a UNA de las placas de gel de agar preparadas con la pipeta.
• Extienda y distribuya suavemente las bacterias por toda la placa con un asa de inoculación estéril.
• Tenga cuidado de no romper el agar. 
• Deslice el asa de inoculación por diferentes áreas para que crezcan colonias grandes.
• Vuelva a colocar la tapa en la placa de gel de agar y deje que el agua se seque / se evapore antes de guardarla. 
• Coloque la placa boca abajo (con el agar hacia arriba) para que la condensación no gotee desde la tapa sobre el agar.
• Deje que la placa se incube y crezca a temperatura ambiente (18-20°C) durante 12-18 horas. 
• Verá colonias de bacterias de color blanco que indican crecimiento.
• Compruebe la bioluminiscencia después de 12 horas exponiendo la placa de cultivo a la oscuridad.
• Una vez que la placa de agar con bacterias comience a brillar, se puede usar para inocular las otras 6 placas de gel de agar y preparar 3 cultivos líquidos.
• Evite colocar las bacterias en áreas donde la temperatura supere los 30°C, ya que la proteína responsable de la bioluminiscencia se desnaturalizará y dejará de brillar.
• Puede guardar las placas en el refrigerador (4°C) hasta por 2 semanas.

⌬ PASO 3: PREPARACIÓN DE CULTIVOS LÍQUIDOS DE BACTERIAS (3 botellas)

• Vierta el contenido de UNO de los tubos etiquetados como MEDIO DE CALDO DE AMPICILINA en la botella de vidrio de 250 ml.
• Añada 200 ml de agua del grifo a la botella de vidrio usando el tubo cónico etiquetado como MEASURE (4 tubos - 50 ml cada uno)
• Enrosque la tapa de la botella, agite bien y coloque la botella de vidrio en una posición estable a temperatura ambiente.
• Deje que el líquido se asiente durante un par de minutos antes de añadir las bacterias.
• Cuando todo el polvo se haya disuelto, use un ASA DE INOCULACIÓN ESTÉRIL para raspar suavemente una pequeña cantidad de bacterias (una perla de 0,1-0,5 cm de diámetro) de una de las placas que preparó y déjelas caer o mézclelas suavemente en la botella de agar líquido.
• Deje que la botella se incube y crezca a temperatura ambiente (18-20°C) durante 6-12 horas. 
• El líquido se volverá amarillo turbio después de 6+ horas, lo que indica crecimiento.
• No agite la botella durante la mezcla o incubación de las bacterias.
• Compruebe la bioluminiscencia después de 10 horas agitando suavemente el cultivo líquido para introducir oxígeno.
• Una vez que el cultivo líquido de bacterias comience a brillar, estará completamente maduro y deberá guardarse en un lugar fresco y oscuro.
• Para renovar el brillo, simplemente prepare una nueva botella de AGAR LÍQUIDO AMP y añada unas gotas de su antiguo cultivo líquido brillante a la nueva botella de nutrientes y déjela reposar a temperatura ambiente durante 6-12 horas para que crezca.
• Puede guardar el cultivo líquido en el refrigerador (4°C) hasta por 2 semanas.

NOTAS ADICIONALES

⌬ Los viales de bacterias proporcionados están liofilizados y se pueden enviar a temperatura ambiente, pero deben guardarse en el congelador al recibirlos. 

⌬ Nunca guarde el medio de agar preparado ni los cultivos de bacterias inoculados en el congelador. 

⌬ Evite colocar las bacterias en áreas donde la temperatura supere los 30°C, ya que la proteína responsable de la bioluminiscencia se desnaturalizará y dejará de brillar. 

⌬ Trabaje en un entorno estéril y use mascarilla y guantes para evitar la contaminación del cultivo. El agar es un medio rico en nutrientes y puede cultivar muchos tipos de bacterias. Tenga en cuenta que solo está intentando cultivar UN tipo.