HƯỚNG DẪN NUÔI CẤY VI KHUẨN PHÁT QUANG

NUÔI CẤY VI KHUẨN PHÁT QUANG

⌬ Khi làm cấy vi khuẩn dạng lỏng, tốt nhất nên dùng một lượng vi khuẩn tươi nuôi cấy khoảng nửa cm để cấy vào môi trường dinh dưỡng dạng lỏng. Chúng tôi cung cấp 2 lọ vi khuẩn phát quang dung tích 5 ml cùng đủ môi trường dinh dưỡng (Agar) để nuôi nhiều cấy vi khuẩn! 

⌬ Để nuôi thêm vi khuẩn, chúng tôi đã bao gồm 1 ống bột môi trường AGAR AMPICILLIN (đủ môi trường dinh dưỡng để nuôi 7 đĩa cấy) và 3 ống bột môi trường BROTH AMPICILLIN (đủ môi trường lỏng để nuôi 3 cấy vi khuẩn dạng lỏng dung tích 250 ml) 

⌬ Tất cả những điều này chỉ từ một lọ vi khuẩn nhỏ 5 ml! 

THÀNH PHẦN BAO GỒM:

⌬ 1 chai thủy tinh 250 ml

⌬ 1 ống AGAR GEL AMP

⌬ 3 ống BROTH LỎNG AMP

⌬ 7 đĩa Petri

⌬ 10 găng tay Nitrile

⌬ 5 que cấy vô trùng

⌬ 1 ống đong hình nón 50 ml

⌬ 5 ống nhỏ giọt dùng một lần

⌬ 1 lọ H2O vô trùng 

⌬ 2 lọ vi khuẩn e.coli không gây bệnh (thêm 1 lọ dự phòng!)

     - plasmid PJE202 của vibrio fischeri đã được biến đổi

⌬ BƯỚC 1: LÀM ĐĨA AGAR

⌬ Bước này rất quan trọng để nuôi thêm vi khuẩn. Bạn phải chuẩn bị đĩa dinh dưỡng để vi khuẩn phát triển và nhân lên, từ đó có thể thu thập thêm vi khuẩn để tiếp tục sử dụng trong cấy vi khuẩn dạng lỏng. 

• Đổ toàn bộ nội dung của ống có nhãn LB AMPICILLIN AGAR MEDIA vào chai thủy tinh 250 ml. (Đây là Agar dùng để đổ đĩa)
• Thêm 150 ml nước máy vào chai thủy tinh bằng ống hình nón có nhãn MEASURE (3 ống - mỗi ống 50 ml)
• Lắc đều và đặt chai thủy tinh vào lò vi sóng, nới lỏng nắp và đặt nhẹ lên trên. 
• KHÔNG VÍT CHẶT NẮP KHI ĐỂ TRONG LÒ VI SÓNG.
• Làm nóng chai trong lò vi sóng mỗi lần vài giây (5-10 giây) và cẩn thận không để nội dung bên trong sôi quá mức. 
• Mở lò vi sóng và để chai nguội trong vài giây. 
• Tiếp tục làm nóng trong lò vi sóng theo từng khoảng thời gian ngắn mà không để sôi trong 2-5 phút, hoặc cho đến khi chất lỏng trở nên vàng trong và không còn thấy hạt nào.
• Lấy chai ra khỏi lò vi sóng và để nguội đến khi ấm vừa phải (20-30 phút).
• Khi chai còn ấm, hãy đổ vào từng đĩa Petri một.
• Mở nắp mỗi đĩa và đổ vừa đủ Agar để phủ nửa dưới của đĩa (sâu 1-2 mm).
• Nhẹ nhàng đậy nắp lại và để các đĩa nguội ở nhiệt độ phòng trong ít nhất một giờ. Agar sẽ đông lại khi nguội.

⌬ BƯỚC 2: LÀM ĐĨA AGAR NUÔI VI KHUẨN (7 Đĩa)

• Dùng ống nhỏ giọt, thêm 4 giọt H2O vô trùng vào lọ có nhãn FREEZE DRIED BACTERIA. Vặn nắp và lắc trong vài giây.
• Dùng ống nhỏ giọt thêm toàn bộ vi khuẩn vào MỘT trong các đĩa Agar gel đã chuẩn bị.
• Dùng que cấy vô trùng nhẹ nhàng vạch và trải đều vi khuẩn ra xung quanh.
• Cẩn thận không làm vỡ Agar. 
• Dùng que cấy di chuyển quanh các khu vực khác nhau để nuôi các khuẩn lạc lớn.
• Đậy nắp đĩa Agar gel lại và để nước khô / bay hơi trước khi bảo quản. 
• Lật ngược đĩa (mặt Agar hướng lên trên) để hơi nước ngưng tụ không nhỏ từ nắp xuống Agar.
• Để đĩa ủ và phát triển ở nhiệt độ phòng (18-20°C) trong 12-18 giờ. 
• Bạn sẽ thấy các khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng cho thấy sự phát triển.
• Kiểm tra khả năng phát quang sau 12 giờ bằng cách để đĩa nuôi cấy trong bóng tối.
• Khi đĩa Agar vi khuẩn bắt đầu phát sáng, nó có thể được dùng để cấy sang 6 đĩa Agar gel còn lại và làm 3 cấy vi khuẩn dạng lỏng.
• Tránh để vi khuẩn ở những khu vực có nhiệt độ vượt quá 30°C, nếu không protein chịu trách nhiệm phát quang sẽ bị biến tính và ngừng phát sáng.
• Bạn có thể bảo quản các đĩa trong tủ lạnh (4°C) tối đa 2 tuần.

⌬ BƯỚC 3: LÀM CẤY VI KHUẨN DẠNG LỎNG (3 Chai)

• Đổ toàn bộ nội dung của MỘT trong các ống có nhãn AMPICILLIN BROTH MEDIA vào chai thủy tinh 250 ml.
• Thêm 200 ml nước máy vào chai thủy tinh bằng ống hình nón có nhãn MEASURE (4 ống - mỗi ống 50 ml)
• Vặn nắp chai, lắc đều và đặt chai thủy tinh ở vị trí ổn định ở nhiệt độ phòng.
• Để chất lỏng lắng trong vài phút trước khi thêm vi khuẩn.
• Khi toàn bộ bột đã tan, dùng QUE CẤY VÔ TRÙNG nhẹ nhàng lấy một lượng nhỏ vi khuẩn (viên đường kính 0,1-0,5 cm) từ một trong các đĩa bạn đã làm và nhẹ nhàng nhỏ hoặc trộn vào chai Agar lỏng.
• Để chai ủ và phát triển ở nhiệt độ phòng (18-20°C) trong 6-12 giờ. 
• Chất lỏng sẽ trở nên vàng đục sau hơn 6 giờ, cho thấy vi khuẩn đang phát triển.
• Không lắc chai trong quá trình trộn vi khuẩn hoặc ủ.
• Kiểm tra khả năng phát quang sau 10 giờ bằng cách nhẹ nhàng xoay chất lỏng nuôi cấy để cung cấp oxy.
• Khi cấy vi khuẩn dạng lỏng bắt đầu phát sáng, nó đã hoàn toàn trưởng thành và nên được bảo quản ở nơi mát, tối.
• Để làm mới độ phát sáng, chỉ cần làm một chai AMP LIQUID AGAR mới và thêm vài giọt cấy vi khuẩn dạng lỏng phát sáng cũ của bạn vào chai dinh dưỡng mới, sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 6-12 giờ để phát triển.
• Bạn có thể bảo quản cấy vi khuẩn dạng lỏng trong tủ lạnh (4°C) tối đa 2 tuần.

GHI CHÚ BỔ SUNG

⌬ Các lọ vi khuẩn được cung cấp ở dạng đông khô và có thể vận chuyển ở nhiệt độ phòng nhưng nên được bảo quản trong tủ đông khi nhận hàng. 

⌬ Tuyệt đối không bảo quản môi trường Agar đã chuẩn bị hoặc cấy vi khuẩn trong tủ đông. 

⌬ Tránh để vi khuẩn ở những khu vực có nhiệt độ vượt quá 30°C, nếu không protein chịu trách nhiệm phát quang sẽ bị biến tính và ngừng phát sáng. 

⌬ Làm việc trong môi trường vô trùng, đeo khẩu trang và găng tay để tránh làm nhiễm cấy. Agar là môi trường giàu dinh dưỡng và có thể nuôi nhiều loại vi khuẩn. Hãy nhớ rằng bạn chỉ đang cố gắng nuôi DUY NHẤT một loại!