INSTRUÇÕES PARA CULTURA MICROBIANA DE BACTÉRIAS BIOLUMINESCENTES

CULTURANDO BACTÉRIAS BIOLUMINESCENTES

⌬ Ao preparar culturas líquidas de bactérias, o ideal é usar uma pequena porção de cerca de meio centímetro de bactérias frescas cultivadas para inocular o caldo nutritivo líquido. Fornecemos 2 frascos de 5 ml de bactérias bioluminescentes e nutrientes suficientes (ágar) para cultivar várias culturas! 

⌬ Para cultivar mais bactérias, incluímos 1 tubo de MEIO DE ÁGAR EM PÓ COM AMPICILINA (nutrientes de ágar suficientes para 7 culturas em placas) e 3 tubos de MEIO DE CALDO EM PÓ COM AMPICILINA (nutrientes líquidos suficientes para 3 culturas líquidas de 250 ml) 

⌬ Tudo isso a partir de apenas um pequeno frasco de 5 ml de bactérias! 

O QUE ESTÁ INCLUSO:

⌬ 1 frasco de vidro de 250 ml

⌬ 1 tubo de ÁGAR EM GEL COM AMP

⌬ 3 tubos de ÁGAR LÍQUIDO COM AMP

⌬ 7 placas de Petri

⌬ 10 luvas de nitrilo

⌬ 5 alças de inoculação estéreis

⌬ 1 tubo cônico medidor de 50 ml

⌬ 5 pipetas descartáveis

⌬ 1 frasco de H2O estéril 

⌬ 2 frascos de bactérias e. coli não patogênicas (1 extra!)

     - plasmídeo modificado PJE202 de vibrio fischeri

⌬ PASSO 1: PREPARANDO PLACAS DE ÁGAR

⌬ Este passo é crucial para cultivar mais bactérias. Você deve preparar as placas nutritivas para que elas cresçam e se multipliquem, permitindo coletar mais bactérias para uso posterior em culturas líquidas. 

• Despeje o conteúdo do tubo rotulado como MEIO DE ÁGAR LB COM AMPICILINA no frasco de vidro de 250 ml. (Este é o ágar para preparar as placas)
• Adicione 150 ml de água da torneira ao frasco de vidro usando o tubo cônico rotulado como MEDIR (3 tubos - 50 ml cada)
• Agite bem e coloque o frasco de vidro no micro-ondas com a tampa desrosqueada e apoiada levemente por cima. 
• NÃO ROSQUEIE A TAMPA FORTEMENTE NO MICRO-ONDAS.
• Aqueça o frasco no micro-ondas por alguns segundos de cada vez (5 a 10 segundos) e tome cuidado para não ferver o conteúdo em excesso. 
• Abra o micro-ondas e deixe o frasco descansar por alguns segundos para esfriar. 
• Continue aquecendo no micro-ondas em intervalos curtos, sem deixar ferver, por 2 a 5 minutos ou até que o líquido fique amarelo claro e sem partículas visíveis.
• Retire o frasco do micro-ondas e deixe-o esfriar até atingir uma temperatura morna (20 a 30 minutos).
• Enquanto o frasco ainda estiver morno, despeje nas placas de Petri uma de cada vez.
• Retire a tampa de cada placa e despeje apenas o suficiente de ágar para cobrir a metade inferior da placa (1 a 2 mm de profundidade).
• Recoloque as tampas com cuidado e deixe as placas esfriarem em temperatura ambiente por pelo menos uma hora. O ágar solidificará ao esfriar.

⌬ PASSO 2: PREPARANDO PLACAS DE ÁGAR COM BACTÉRIAS (7 Placas)

• Usando uma pipeta, adicione 4 gotas de H2O estéril ao frasco rotulado como BACTÉRIAS LIOFILIZADAS. Rosqueie a tampa e agite por alguns segundos.
• Adicione todas as bactérias em UMA das placas de ágar gel preparadas usando a pipeta.
• Espalhe e distribua as bactérias suavemente por toda a placa usando uma alça de inoculação estéril.
• Cuidado para não quebrar o ágar. 
• Passe a alça de inoculação em diferentes áreas para cultivar grandes colônias.
• Recoloque a tampa na placa de ágar gel e deixe a água secar/evaporar antes de armazenar. 
• Vire a placa de cabeça para baixo (com o lado do ágar para cima) para que a condensação não escorra da tampa sobre o ágar.
• Deixe a placa incubar e crescer em temperatura ambiente (18-20°C) por 12-18 horas. 
• Você verá colônias de bactérias brancas, indicando crescimento.
• Verifique a bioluminescência após 12 horas expondo a placa de cultura à escuridão.
• Assim que a placa de ágar com bactérias começar a brilhar, ela poderá ser usada para inocular as outras 6 placas de ágar gel e preparar 3 culturas líquidas.
• Evite colocar as bactérias em locais onde a temperatura exceda 30°C, pois a proteína responsável pela bioluminescência sofrerá desnaturação e parará de brilhar.
• Você pode armazenar as placas na geladeira (4°C) por até 2 semanas.

NOTAS ADICIONAIS

⌬ Os frascos de bactérias fornecidos são liofilizados e podem ser enviados em temperatura ambiente, mas devem ser armazenados no freezer assim que chegarem. 

⌬ Nunca armazene meio de ágar preparado ou culturas de bactérias inoculadas no freezer. 

⌬ Evite colocar as bactérias em locais onde a temperatura exceda 30°C, pois a proteína responsável pela bioluminescência sofrerá desnaturação e parará de brilhar. 

⌬ Trabalhe em um ambiente estéril e use máscara e luvas para evitar a contaminação da cultura. O ágar é um meio rico em nutrientes e pode cultivar muitos tipos de bactérias. Lembre-se de que você está tentando cultivar apenas UM tipo!